### 第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行相对定量时，内参基因的选择至关重要。应遵循以下原则来确保实验结果的可靠性：

(1) 选择表达丰度均匀且稳定的基因作为内参基因；

(2) 不要盲目依赖常用的内参基因；

(3) 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tubulin。

选择合适的内参基因对实验结果的有效性具有决定性影响，加入内参后，结果将进行计算。

二、绝对定量

绝对定量是通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。用于绝对定量的标准品包括：

A. 拥有明确拷贝数浓度的样品；

B. 克隆质粒；

C. PCR产物；

D. cDNA（对于扩增效率的测定等用途有效，但绝对定量不适用）。

在计算拷贝数时，应参考以下平均分子量（MW）：

dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)；

ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)；

ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。

拷贝数计算公式为：

(6.022 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml。

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